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编辑:华体会体育|官方首页时间:2022-05-30 13:00点击量:142

  胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术蛋白表达是指利用细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细,的重要组成部分之一是基因工程技术中。有一定翻译后修饰等优点而被越来越多的使用毕赤酵母表达系统由于其低成本高产出并具。

  酿酒酵母表达系统酵母表达系统包括,及其他酵母表达系统甲醇酵母表达系统以。甲醇营养型酵母毕赤酵母属于,一碳源 [1] 能够将甲醇作为唯。系统有哪些优势呢那么毕赤酵母表达,以下主要几点我们总结了:

  拥有目前最强( 1 ),氧化酶基因 AOX1 启动子调控机理最严格的启动子之一醇,表达调控 [1] 非常利于外源基因的;

  工修饰功能例如磷酸化、糖基化等( 2 )具有翻译后的蛋白加,势的线 )既可以在细胞内表达是一种不可多得的集聚多种优,表达 [1] 也可在细胞外;

  贝的形式在特定的位点整合进酵母染色体上( 5 )外源基因可以单拷贝或者多拷,的复制而复制伴随着染色体,遗传稳定性有较高的,表达菌株存在 [2] 同酿酒酵母一样以稳定的;

  进行大规模发酵( 6 )可以,密度培养适合高,的工业放大化生产制备非常适合重组真核蛋白。

  类型有四种(如表 1 )毕赤酵母宿主菌常用的菌株,M71H 、 SMD116 [3] 分别是X33、 GS115 、 K。 是野生型菌株其中 X33, KM71H 两种而 GS115 和,4 营养缺陷标记都具有 HIS。有 AOX1 基因GS115 菌株具,ut+ 属于 M,利用正常型指的是甲醇;1 位点被 ARG4 基因插入KM71 H 菌株的 AOX,uts 属于 M,用缓慢型指甲醇利,酵母转化方法 [2] 两种菌株都适用于一般的。ep4 )属于蛋白酶缺失型菌株SMD116 ( his4 p,引起的的表达产物分布不均的问题它能够表达一些由于蛋白降解而。is4 pep4 )菌株生长缓慢只是由于 SMD116 ( h,源蛋白质产量低导致表达的外。

  A (载体图谱如图 1 )、 pPIC9K 等毕赤酵母分泌表达载体主要有: pPICZ α 。r) 引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的正确分泌 [1] 使用酿酒酵母的分泌信号 — α交配因子 ( α -facto。华体会app下载手机版-苹果版下载 、 pPICZA 、 pPIC3.5K 等毕赤酵母胞内表达载体主要有: pPIC3K。 载体用于毕赤酵母胞内蛋白表达目前平台提供 pPICZ A, 用于分泌蛋白的表达pPICZ α A,X1 启动子来诱导表达所有载体均利用 AO。

  ]三种内切酶中的一种酶(请确保插入的目的基因不含有此酶切位点)对表达质粒进行线性化酶切使用Sac I(209bp)、PmeI(414bp)、BstX I(707bp) [3,PICZα的5’AOX1位点处进行酶切这时内切酶会在表达载体pPICZ或者p。(确保酶切的质粒大于5μg)通常酶切切体系为100μL,是否被切开(参考图4a)酶切完后跑电泳检验质粒。

  上层水样(3)取,L预冷无水乙醇加入500μ,20度置于—,h1,20min4度离心,上清去;

  YPD(大概能做10支)(1)将酵母菌划线mL ,7℃2,rpm220,夜过;

  r DNA(大于5μg)进行电转(8)取100μL+linea,片对两电极电转杯金属,面突起向外电转杯侧,NA后加入D,孔电击条件:电压:1500V需在冰上放置5min(电穿,400Ω电阻:,25μF电容:,:10mS脉冲时间,电击)一次;

  -3天后平板上会长出转化子(参考图4c)(12) 置于27-30度培养箱培养2。

  的板子筛选转化子(1)使用高抗性,上长出单菌落待YPD板,单菌落挑取,管中涮一下在PCR,验证(参考图5)根据结果随后进行PCR菌落筛选,MGY的小三角瓶中转接入含50mlB,0℃3,rpm200,0=1-1.5培养至OD60;

  体系转移入100ml离心管(2)将小三角瓶中的培养,00g30,n收菌5mi;

  0ml的大三角瓶中(4)转移至50,0℃3,始诱导表达培养200rpm开,速冻后保存于-80℃间隔时间取出1ml,0.5%的甲醇并补充终浓度,4h、48h、72h、96h取样时间点:0h、12h、2;

  一定天数的毕赤酵母离心( 1 )将诱导表达,泌表达则收取上清如果目的蛋白是分,培养基并将上清置换成裂解缓冲液可以通过我们平台的浓缩包浓缩。白是胞内表达如果目的蛋,母细胞破碎则需要将酵,毕赤酵母细胞破碎(参考图 6 )可以使用我们平台的高压均质机将。

  经成功高效表达了多个蛋白近年来毕赤酵母表达系统已,又提高了表达量不仅降低了成本,-淀粉酶例如a,产量都能达到g/L的量级肿瘤坏死因子(TNF)等,源蛋白表达系统之一是目前最为成功的外。还将会用于更多外源蛋白的表达有理由相信毕赤酵母表达系统,物医药在生,下浓墨重彩的一笔美容护肤等领域留。术中心蛋白质制备与鉴定平台(来源清华大学蛋白质研究技)

  生命的化学》2003年23卷1期1.酵母表达系统及其应用研究《,、蒋建新吴丽娟;

  白(rHSA)的条件优化试验研究2.毕赤酵母表达重组人血清白蛋。硕士学位论文河南师范大学,刚刚杨;

  物学免疫学进展》2004年第32卷第1期4.毕赤酵母表达外源基因研究进展《微生,刘哲伟王勇、;

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